Q&A | 液相色譜柱常見問題解答

發布時間： 2024-07-02　　點擊次數： 1625次

今天我們就匯總了一些液相色譜柱使用過程中的常見問題，并給出針對性的解決方案。快來看看是不是問到了你的心坎上呢？

問題 1：我的液相色譜柱上進樣量多少合適，同時可以避免譜帶展寬？

進樣量以及最佳流速受色譜柱尺寸限制。理想情況下，如果樣品與流動相使用相同的溶劑，進樣量范圍如下：

液相柱內徑 ID	進樣量 (µL)
2.1 mm (30 -100 mm 長)	1-3
3.0-3.2 mm (50-150 mm 長)	2-12
4.6 mm (50-250 mm 長)	8-40

問題 2：如果我改用其它尺寸的色譜柱，應該如何調整進樣量？

最佳進樣量與色譜柱的柱體積相關，因此取決于色譜柱的橫截面積（A = π r²）和長度（L）。您可以根據現有方法的進樣量估算調整后的進樣量。如果要轉換為不同內徑（ID）的色譜柱（包裝材料和長度保持不變），只需將當前進樣量乘以新舊色譜柱的半徑平方之比即可確定新方法的正確進樣量。

例如，如果當前在 150 x 4.6 mm 色譜柱上進樣量為 20 μL，準備切換到 150 x 3.0 mm 的色譜柱，則新色譜柱進樣量為 20 x (1.5²) / (2.3²)，約為 8.5 μL。

問題 3：如果樣品/標準品所使用溶劑比我的初始流動相洗脫能力強，會發生什么情況？

圖 1：溶劑效應對峰形的影響

會發生溶劑效應，通常會導致峰變形、靈敏度差和保留時間縮短等問題。例如毒物分析中的PFAS 分析中的 PFBA 會容易受溶劑效應影響，因此我們建議使用與初始流動相相近的溶劑來避免溶劑效應。如果不便于這樣做，請在確保溶劑與流動相可以混溶的前提下盡量減小進樣體積來消弱溶劑效應。

問題 4：如何確定液相色譜柱的總柱體積或空隙體積？

術語“色譜柱體積"通常是指空隙體積，它代表二氧化硅顆粒之間的流動相體積。空隙體積可以通過總柱體積（ π r² L）乘以對應色譜柱的裝填系數來獲得。對于全多孔色譜柱，計算空隙體積（mL）的公式為 V = 0.68 π r² L，其中 V = 柱體積，單位為 mL；r = 柱截面半徑，單位為厘米；L = 柱長，單位為厘米。對于表面多孔的色譜柱，例如我們的 Raptor 色譜柱，系數不同，空隙體積（mL）的公式為 V = 0.50π r²L 。

空隙體積通常通過進特定標準品進行實驗測定，該標準品需要在待測色譜柱上無保留或保留可以忽略不計。反相色譜柱常用測試化合物是尿嘧啶。需要注意的是，對于所使用的特定液相儀器，測定值還受到柱外死體積的影響，因此可能會略有不同。

問題 5：使用惰性色譜柱有什么好處？哪類化合物更適合用 Inert 惰性液相柱分析？

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當通過 HPLC 分析金屬敏感化合物時，流路中最大的金屬面積是液相色譜柱的柱管。對柱管內壁進行惰性化處理的 Inert 色譜柱，可以消除金屬敏感化合物與金屬之間的非特異性吸附。從而為這類化合物提供更好的峰形和響應。

這類化合物包括：磷酸類化合物、酸性化合物、生物分子-蛋白質、核苷酸、寡核苷酸等。

圖 2：待測物與金屬之間的非特異吸附

問題 6：分析金屬敏感化合物時，除了使用 Inert 惰性液相柱，我需要鈍化 HPLC 管路嗎？

如果您使用的液相儀器不是惰性 HPLC 系統，有可能需要對 HPLC 管路進行鈍化，因為從進樣器到色譜柱之間流路中的金屬可能會對某些金屬敏感化合物產生一定影響。具體鈍化方法，歡迎您聯系我們獲取針對性的幫助。

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